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    技術支持

    PCR反應中主要物質詳解

    更新時間:2023-12-26   點擊次數:137次

    參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

    01.引物

    引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

    設計引物應遵循以下原則:

    ①引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。

    ②引物擴增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。

    ③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

    ④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。

    ⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

    ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

    ⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以最di引物量產生所需要的結果為宜。引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。

    02.酶及其濃度

    目前有兩種Taq DNA聚合酶,一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少。

    03.dNTP的質量與濃度

    dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris-HCL緩沖液將其pH值調節到7.0~7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。

    在PCR反應中,dNTP應為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)。當其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。

    04.模板(靶基因)核酸

    模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關鍵環節之一。傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理樣本。SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS還能與蛋白質結合而沉淀;

    蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

    05.Mg2+濃度

    Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響。在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增;濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少。

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